Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

– Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

– Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики – выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

– Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

– Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Если стоит задача выявления антител, то сделать это возможно при помощи реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В лунку с вирусом и эритроцитами закапывают различные пробы. При наличии антител они свяжут вирус, и эритроциты упадут на дно с образованием «пуговки».

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

– Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

– Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

– Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса – возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

Ключевые методы лабораторной диагностики распространенных инфекций

Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.

Особенности диагностики инфекционных заболеваний

В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.

Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.

Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.

К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.

Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.

Методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций

Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:

Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.

Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.

Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.

Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.

Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.

Диагностика вирусных инфекций

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:

Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.

Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.

Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.

Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.

Методы диагностики протозойных инфекций

Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:

Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.

Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.

Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.

Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.

В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.

Диагностика грибковых инфекций

Грибковые инфекции распространены не так широко, как вирусные или бактериальные потому, что они поражают в основном людей с ослабленным иммунитетом. Обычно при словах «грибковая инфекция» люди думают о заболеваниях кожи и ногтей, но сфера деятельности микозов шире: они могут поражать практически любые ткани. Самые распространенные грибковые поражения – это кандидоз, или молочница, микозы стоп, аспергиллез. При диагностике грибковых инфекций чаще всего используются следующие лабораторные методы:

Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.

Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.

Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.

Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.

Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.

Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.

Пе­ред сда­чей био­ма­те­ри­а­ла для ис­сле­до­ва­ний иног­да тре­бу­ет­ся опре­де­лен­ная под­го­тов­ка. Так, кровь обыч­но сда­ют с ут­ра, на­то­щак, а пе­ред за­бо­ром маз­ка не ре­ко­мен­ду­ет­ся при­ни­мать душ. Эти тре­бо­ва­ния очень важ­ны: они обес­пе­чи­ва­ют точ­ность ре­зуль­та­та, по­это­му узнай­те у вра­ча за­ра­нее о под­го­то­ви­тель­ных ме­рах и точ­но сле­дуй­те всем его ре­ко­мен­да­ци­ям.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

С целью диагностики вирусных инфекций применяются следующие методы:

Ø Вирусоскопический – обнаружение в исследуемом материале вирусов с помощью световой (крупные вирусы, внутриклеточные включения вирусов), люминесцентной и электронной микроскопии;

Ø Вирусологический – выделение вирусов из исследуемого материала с последующей их идентификацией (установление вида и типа вируса посредством серологических реакций);

Ø Серологический – обнаружение в исследуемом материале антигенов вирусов или вирусоспецифических антител;

Ø Биологический – заражение вируссодержащим материалом лабораторных животных;

Ø Молекулярно-биологический – выявление в исследуемом материале нуклеиновых кислот вирусов (ПЦР, ДНК-зонды);

Ø Экспресс-методы – выявление антигенов вирусов в короткие сроки (РИФ);

Ø Аллергологический – выявление ГЗТ к вирусу.

Этапы вирусологического метода исследования:

1. Взятие материала (выбор материала определяется клиническими признаками заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения), транспортировка в лабораторию и подготовка к исследованию (для подавления сопутствующей бактериальной флоры обрабатывают антибиотиками).

2. Заражение исследуемым материалом чувствительной модели. Вирусы в отличии от бактерий не растут на питательных средах, т.к. являются абсолютными (облигатными) паразитами, поэтому для их культивирования применяются особые модели:

Ø в организме восприимчивых животных;

Ø в куриных эмбрионах (овокультуры);

Ø в культуре клеток.

3. Культивирование вируса в зараженной модели при стандартных условиях (оптимальная температура, продолжительность культивирования).

4. Индикация (обнаружение) вируса в зараженной модели.

5. Идентификация выделенного вируса в серологических реакциях.

Достоинство вирусологического метода – 100% достоверность.

Культивирование вирусов в организме чувствительных животных – на первом этапе развития вирусологии был единственным методом, доказывающим наличие фильтрующихся агентов в исследуемом материале.

Требования, предъявляемые к лабораторным животным:

Ø животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

Ø использование новорожденных/молодых особей;

Ø использование инбридных (беспородных) животных/гнотобионтов (выращены в безмикробной среде);

Ø использование здоровых животных одной линии (одного пола, возраста, веса, содержащихся в одинаковых условиях).

Способ заражения животных определяется тропизмом вируса (способностью репродуцироваться в определенных типах клеток):

Ø нейротропен (например, вирус бешенства) – вводится интрацеребрально;

Ø пневмотропен (например, РС-вирусы) – интраназально;

Ø дерматропен (например, вирус натуральной оспы) – внутрикожно;

Ø пантропен – внутривенно/внутрибрюшинно.

Методы индикации вируса в организме лабораторного животного:

1) клинические симптомы заболевания;

2) гибель животного;

3) патоморфологические изменения органов при вскрытии.

Достоинства – выделение тех вирусов, которые не культивируются в куриных эмбрионах и культурах клеток.

Недостатки – контаминация животных посторонними микроорганизмами.

Культивирование вирусов методом овокультур – заражение вирусами куриных эмбрионов.

Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам:

Ø должны быть из эпидемиологически благополучных хозяйств;

Ø скорлупа должна быть чистой, непигментированной, без механических повреждений;

Ø возраст – 5-12 дней (недостаточно противовирусных ингибиторов).

Способы заражения куриных эмбрионов:

Ø закрытый (прокол иглой под контролем овоскопа);

Ø открытый (с удалением части скорлупы).

Исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотические полости, хорион-аллантоисную оболочку и желточный мешок. Перед заражением скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70% этиловым спиртом и фломбируют (обжигают на пламени). После заражения отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином. Инкубируют при 35-37 0 С ≈ 48 часов.

Методы индикации вируса в куриных эмбрионах:

1) результаты овоскопии – отсутствие подвижности эмбриона, слабая инъецированность сосудов кровью и отсутствие их пульсации;

2) паталогоанатомические изменения на хорион-аллантоисной оболочке – отечность, кровоизлияния, наличие оспинок (узелков);

3) отставание эмбриона в росте и развитии, пороки развития, гибель;

4) положительная реакция гемагглютинации (РГА) – через 5-10 минут при смешивании аллантоисной жидкости и суспензии эритроцитов (кур, гусей, уток, морских свинок и других животных) на дне лунки полистеролового планшета образуется осадок в виде «перевернутого зонтика» вследствие склеивания эритроцитов под действием вируса (отрицательная РГА – эритроциты не склеиваются и выпадают в осадок в виде «пуговки»).

Достоинства – высокая чувствительность к большому спектру вирусов.

Недостатки – обнаружение вируса только после вскрытия эмбриона.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

При ряде инфекционных заболеваний организм приобретает повышенную чувствительность к аллергенам бактерий их вызывающих. Этот феномен помогает установлению этиологического диагноза. В ряде случаев специфическая бактериальная аллергия формируется рано, в первые дни болезни, что используют в целях ранней диагностики туляремии (внутрикожная аллергическая проба с тулярином становится положительной на 2-й – 3-й день).

В других случаях аллергическая перестройка организма происходит позднее и выявление специфической аллергии может быть использовано в интересах ретроспективного диагноза. Методы гипосенсибилизации организма с помощью соответствующих аллергенов используют для лечения больных некоторыми хроническими формами болезней. Лечебное применение бактериальных аллергенов оправдано в случаях, когда антибактериальная терапия и другие методы лечения не достигают успеха и болезнь приобретает хроническое рецидивирующее течение.

К таким нозологиям в настоящее время можно отнести ряд инфекционных болезней, дающих хронические формы нелегочный туберкулез (поражение сетчатки глаза), бруцеллез (рецидивирующий миокардит), токсоплазмоз (поражения опорно-двигательного аппарата).

Аллергические пробы (накожные и внутрикожные) получили всеобщее признание в диагностике таких бактериальных инфекций, как туляремия, бруцеллез (проба Бюрне), туберкулез (накожная проба Пиркета и внутрикожная проба Манту) токсоплазмоз, грибковые поражения кожи, сап и риккетсиозы (лихорадка Ку). Наиболее проста для выполнения накожная аллергическая проба в сравнении с внутрикожной и другими способами введения аллергена.

Методика внутрикожной аллергической пробы состоит в следующем: на сгибательную поверхность предплечья или на кожу плеча (после обработки 70% спиртом) наносится капля аллергена и через нее производят легкую скарификацию (без появления крови!). Положительная проба (через 24 и 48 ч) при наличии сенсибилизации организма к вводимому аллергену проявляется воспалительной реакцией различной интенсивности: краснота, отек, образование пузырьков, иногда с ощущением местного зуда и жжения.

Степень выраженности реакции и ее продолжительность зависят от состояния сенсибилизации организма и концентрации бактериального аллергена (например при диагностике туберкулеза она не должна быть выше 1:10 000 (!) во избежание очаговых реакций в легких, протекающих с деструкцией (!) легочной ткани).

Диагностика вирусных инфекций

В основе лабораторной диагностики вирусных инфекций лежит обнаружение вируса и антител к нему. Материалом для исследования служат биологические жидкости организма и ткани, где вирус содержится в наибольших количествах. В зависимости от характера и стадии болезни исследуют кровь, спинномозговую жидкость, отделяемое конъюнктивы, уретры, шейки матки, носоглоточную слизь, фекалии, мочу и кусочки тканей органов, полученные с помощью прижизненной биопсии или у трупа.

Для вирусологических исследований материал от больного вводят различным лабораторным животным, в куриные эмбрионы и тканевые культуры; выбор материала и метод исследования определяется тропизмом вируса, присущим различным вирусным инфекциям и его способностью к размножению in vivo и in vitro. Идентификация вируса проводится с помощью специфических методов с применением серологических реакций.

В последние годы для диагностики применяют полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), спектр индикации различных вирусов этим методом быстро расширяется. В настоящее время разработана вирусологическая диагностика гепатитов А, В, С, Д, G, TTV; определение вирусов герпеса, цитомегаловирусов, ВИЧ и др. Определяют не только их присутствие в исследуемом материале (кровь и др.), но и количество вирусных частиц (так называемую «вирусную нагрузку» -степень вирусемии и репликацию вируса), что важно не только для диагностики, но и для динамического наблюдения за течением болезни и для оценки эффективности проводимого противовирусного лечения (количество вируса снижается вплоть до его исчезновения).

Наряду с ПЦР сохраняют свое значение некоторые рутинные лабораторные методы диагностики вирусных инфекций: прямая микроскопия мазков-отпечатков из носа для определения ДНК- и РНК-содержащих вирусов; реакция иммунофлюоресценции (РИФ), непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) в диагностике гриппа и других ОРВИ; выделение чистых культур вирусов гриппа для определения их типа.

Широко применяют РСК для определения титра антител у больных в динамике болезни; реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить степень специфического иммунологического ответа организма; применяют также реакции нейтрализации, преципитации в агаре и многие другие специальные вирусологические методы.